使用伯樂（Bio-Rad）CFX Opus 96 進行實時熒光定量PCR實驗時，要獲得準確、可重復的結果，需要注意非常多的細節。這些細節貫穿于實驗準備、程序設置、運行和數據分析的整個過程。

以下是一份詳細的注意事項清單，您可以將它作為標準操作程序的補充參考：

一、伯樂CFX Opus 96實時熒光定量PCR實驗前準備與體系配制

這是整個實驗成功的基礎，“垃圾進，垃圾出" 的原則在這里體現良好。

1、RNA/DNA 模板質量：

純度：確保模板的A260/A280比值在理想范圍內（DNA: ~1.8， RNA: ~2.0），A260/A230 > 2.0，表明沒有蛋白質、酚、鹽類等污染。

完整性：對于RNA，務必通過瓊脂糖凝膠電泳確認其完整性（清晰的28S和18S條帶）。

準確定量：使用微量分光光度計（如NanoDrop）精確測定模板濃度。對于靈敏度要求高的實驗，推薦使用Qubit等熒光定量法進行精確定量。

2、引物和探針：

設計與驗證：使用可靠的軟件設計引物，并通過常規PCR和凝膠電泳驗證其特異性和擴增效率（理想效率在90%-110%之間）。

濃度優化：進行引物濃度梯度優化，找到產生低Ct值、高熒光信號且無非特異性擴增的良好濃度。通常終濃度在100-500 nM之間。

妥善保存：避免反復凍干，建議配制高濃度母液，分裝后于-20℃保存。

3、試劑與體系配制：

Master Mix選擇：根據實驗需求選擇合適的預混液（如SYBR Green或TaqMan探針法）。確認預混液是否包含ROX等被動參考染料（CFX Opus通常不需要，但需根據預混液說明書確認）。

充分解凍和混勻：將所有試劑（預混液、引物、模板）解凍并渦旋振蕩混勻，短暫離心收集管壁液滴。

在冰上操作：酶和熒光染料對溫度敏感，整個配制過程應在冰上進行。

精確移液：使用校準過的移液器和高質量的帶濾芯吸頭，避免交叉污染和取樣誤差。對于低濃度模板，建議增加技術重復（至少3個復孔）。

“無模板對照"和“無逆轉錄對照"：

NTC：必須設置！用于檢測體系是否存在引物二聚體或試劑污染。

對于qRT-PCR：必須設置No-RT Control（用水代替逆轉錄酶），用于檢測基因組DNA污染。

4、加樣與封板：

避免氣泡：加樣時吸頭應深入液面以下，緩慢打出液體，避免產生氣泡。如有氣泡，可在離心機中短暫離心去除。

精確封板：使用光學級封板膜。貼膜時，使用專門的封板器或刮板，確保封板膜平整、無褶皺、密封，防止運行過程中蒸發和交叉污染。

二、伯樂CFX OPUS96實時熒光定量PCR儀器設置與程序編輯

1、創建實驗協議：

熒光通道選擇：根據您使用的染料（如FAM for TaqMan, SYBR Green）正確選擇光學檢測通道。不要選錯，否則檢測不到信號。

三步法 vs 兩步法：通常使用三步法（退火、延伸分開）有助于提高特異性，而兩步法（退火和延伸合并）可以縮短運行時間。請根據引物和預混液的推薦進行選擇。

溫度與時間：嚴格按照預混液和引物說明書推薦的條件設置。常見的錯誤是退火溫度設置不當。

熔解曲線：對于SYBR Green法，熔解曲線分析是必須的！ 程序應自動添加熔解曲線步驟（通常從65℃緩慢升溫到95℃，每0.5℃采集一次信號），用于確認擴增產物的單一性和特異性。

2、板設置：

正確標注樣品類型：在軟件中清晰、準確地定義每個孔的樣品類型（未知樣品、標準品、NTC、NRT等）。這是后續數據分析的基礎。

設置重復和技術重復：如果板上有生物學重復或技術重復，務必在軟件中將其歸為一組，以便軟件自動計算平均值和標準差。

導入/導出模板：對于常規實驗，可以保存板設置模板，下次直接調用，避免手動輸入錯誤。

三、伯樂CFX OPUS96實時熒光定量PCR儀器運行與維護

1、運行前檢查：

確認樣品板在樣品槽中放置平穩，方向正確。

確認熱蓋已擰緊，與反應板接觸良好，以保證傳熱均勻和防止蒸發。

2、儀器維護：

清潔光學元件：定期（如每季度或根據使用頻率）使用儀器配套的清潔工具或無水乙醇和無塵紙清潔光學元件表面，確保熒光檢測的靈敏度和準確性。

軟件更新：保持CFX Maestro軟件的更新，以獲取新的功能和錯誤修復。

四、伯樂CFX OPUS96實時熒光定量PCR數據分析與解讀

1、基線閾值設定：

軟件通常會自動設置，但需要手動檢查。基線應設置在擴增曲線剛剛開始呈指數增長的平坦階段。閾值線應設置在指數擴增期的線性范圍內。所有樣本的基線設置必須一致。

2、Ct值確認：

檢查所有樣本的擴增曲線是否平滑、呈典型的S形。異常的曲線（如起跳過早、平臺期信號低、有多個峰）表明可能存在問題。

確認NTC和No-RT Control的Ct值遠大于目標樣本（通常Ct > 35 或 無Ct值），否則說明存在污染。

3、熔解曲線分析（SYBR Green）：

查看熔解曲線是否為單一、尖銳的峰。如果出現雙峰或寬峰，表明存在引物二聚體或非特異性擴增，該樣本的數據不可信。

4、標準曲線與效率（定量）：

標準品的稀釋必須精確，并且要覆蓋足夠寬的范圍（通常至少5個數量級）。

檢查標準曲線的R2值（應>0.98）和擴增效率（應在90%-110%之間）。如果效率不佳，需要重新優化實驗條件。

5、內參基因的選擇與相對定量（ΔΔCt法）：

選擇穩定的內參基因（如GAPDH, β-actin, 18S rRNA等）至關重要。在不同實驗條件下，內參基因的表達量也可能發生變化，需要進行驗證。

使用ΔΔCt法計算相對表達量時，確保所有計算步驟正確。

五、總結：常見問題排查清單

1、無擴增信號：檢查試劑是否失活、引物是否正確、模板質量/濃度、程序設置（特別是退火溫度）、熒光通道選擇。

2、Ct值過大：模板降解或濃度過低、試劑失效、PCR抑制物存在、程序效率低。

3、重復性差：模板定量不準、移液誤差、試劑未充分混勻、反應板密封不嚴或有氣泡。

4、NTC有擴增：引物二聚體（優化引物濃度/退火溫度）、試劑或環境被模板或擴增產物污染（更換試劑，清潔工作臺）。

5、熔解曲線出現雙峰：引物特異性差、有引物二聚體、退火溫度過低。需要重新設計或優化引物。