伯樂Bio-Rad CFX Opus 96實時熒光定量PCR儀的正確操作使用方法。這是一份詳細的、分步驟的操作指南，旨在幫助您安全、準確、高效地使用該儀器。

一、伯樂CX OPUS96實時熒光定量PCR儀實驗前準備

1、儀器準備

開機：打開儀器主機電源，再打開電腦。啟動 CFX Maestro 軟件。儀器會進行自檢，確保所有指示燈正常。

預熱：儀器開機后預熱10-15分鐘，使光學系統和加熱模塊穩定。

2、軟件準備

在電腦上雙擊打開 CFX Maestro 軟件。

創建新實驗：點擊 New Experiment 或 Create Experiment。

3、實驗設計

明確您的實驗目的：定量、相對定量（基因表達分析）、基因分型等。

設計好您的實驗布局（板布局），包括：

待測樣品：每個樣品設置技術重復（通常2-3個）。

標準品（用于定量）：一系列已知濃度的DNA/cDNA，用于生成標準曲線。

陰性對照：

無模板對照：反應體系中不加任何模板，用于檢測試劑或環境是否存在污染。

無逆轉錄對照：僅用于基因表達分析，檢測基因組DNA污染。

內參基因（用于相對定量）：用于校正樣品間的加樣量和RNA質量差異。

4、反應體系配制（在冰上或冷卻板上操作）

根據您的試劑盒說明書或自行優化的方案，計算并配制 主混合液。

推薦配制順序：在一個1.5 mL無菌無核酸酶離心管中，按以下順序加入：

無核酸酶水

PCR緩沖液、Mg2?等

dNTPs

引物 和 探針（如使用）

熱啟動DNA聚合酶（最后加入，避免室溫下非特異性擴增）

充分混勻并短暫離心。

將主混合液分裝到PCR板或八聯管中。

最后在指定的模板添加區加入模板DNA/cDNA，蓋上管蓋/板膜。

短暫離心PCR板/八聯管，確保所有液體沉于管底且無氣泡。

二、伯樂CFX OPUS96實時熒光定量PCR儀上機操作流程

1、步驟1：放置樣品

打開儀器的樣品槽門。

如果是96孔板：將其平穩地放入樣品槽中，確保板子放置平整，A1孔位于左上角。

如果是八聯管：確保所有管子擺放整齊，卡在支架上，位置正確。

輕柔地關上樣品槽門。

2、步驟2：在CFX Maestro軟件中設置實驗

（1）選擇檢測類型：

點擊 Assay -> Select。

對于SYBR Green I染料：選擇 SYBR® Green。

對于TaqMan探針：選擇 FAM 或其他相應的熒光染料。

對于HRM分析：選擇 HRM。

（2）設置板布局：

在虛擬的96孔板界面上，用鼠標拖動選擇孔位。

為選中的孔位指定 樣品名稱 和 任務。

任務類型包括：

Unknown：未知樣品。

Standard：標準品，并需要輸入其濃度。

NTC：無模板對照。

Positive Control：陽性對照。

（3）編輯實驗協議：

點擊 Protocol 進入編輯界面。一個典型的qPCR程序包括三個階段：

a. 預變性/熱啟動：

溫度：95°C

時間：2-5分鐘（根據酶的要求，激活熱啟動酶并確保模板變性）。

b. 擴增循環（重復40-45個循環）：

變性：95°C，10-30秒。

退火/延伸：60°C（常用），30-60秒。在此步驟采集熒光信號。

注意：如果引物Tm值較低，可能需要分開設置退火和延伸步驟。

c. 熔解曲線分析（僅適用于SYBR Green I）：

儀器會自動生成一個標準熔解曲線程序，通常為：

95°C，10秒

65°C，5秒

然后從65°C緩慢升溫到95°C，每0.5°C采集一次熒光信號。

3、步驟3：啟動運行

保存實驗文件：為您的實驗命名并保存（.pcrd 文件）。

點擊 Start Run。

軟件會彈出一個對話框，讓您再次確認板布局和實驗協議。確認無誤后，點擊 開始。

儀器將開始運行，您可以在軟件界面上實時查看反應進程、擴增曲線和溫度狀態。

三、伯樂CFX OPUS96實時熒光定量PCR儀運行后數據分析

1、查看擴增曲線：

確保所有陽性樣品的擴增曲線呈標準的“S"型，基線平穩，指數期明顯。

檢查NTC對照是否有擴增信號（應無或Ct值>35），如有則表明存在污染。

2、查看熔解曲線（SYBR Green I）：

確保每個樣品只有一個單一的、尖銳的峰。出現多個峰或寬峰表明有引物二聚體或非特異性擴增。

3、進行定量分析：

定量：軟件會根據標準品自動生成標準曲線（R2 > 0.99，效率在90%-110%之間為佳），并計算出未知樣品的起始拷貝數或濃度。

相對定量（ΔΔCt法）：

軟件會先計算每個樣品的內參基因（管家基因）和目標基因的Ct值。

然后通過 ΔCt = Ct(目標基因) - Ct(內參基因)，ΔΔCt = ΔCt(實驗組) - ΔΔCt(對照組)，最終計算出 2^(-ΔΔCt)，即基因表達的相對倍數變化。

4、導出數據：可以將圖表和數據（如Ct值、濃度等）導出為Excel或PDF格式，用于報告和存檔。