賽默飛世爾科技 Applied Biosystems 7500 實時熒光定量PCR系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)、安全操作流程。賽默飛世爾科技 Applied Biosystems 7500 實時熒光定量PCR系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)、安全操作流程。操作必須由經(jīng)過培訓(xùn)的人員在符合生物安全規(guī)定的實驗室中進(jìn)行。不同版本的軟件界面可能略有差異，但核心步驟一致。

賽默飛7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)操作流程

一、開始階段：實驗前準(zhǔn)備

1、儀器準(zhǔn)備

（1）開機(jī)： 依次打開電腦主機(jī)、顯示器，然后打開7500儀器主機(jī)電源（通常在儀器背面）。

（2）啟動軟件： 雙擊桌面上的 “7500 System Software" 圖標(biāo)啟動軟件。軟件將自動進(jìn)行自檢和初始化，此過程約需10-15分鐘。請等待初始化完成，直至主界面就緒。

（3）檢查耗材： 確認(rèn)有足夠的一次性 MicroAmp® Optical 96-Well或8-Strip Reaction Plates（反應(yīng)板）和 Optical Adhesive Covers（光學(xué)封膜）。

2、實驗設(shè)計

（1）創(chuàng)建實驗文件： 在軟件主界面，選擇 “Create New Experiment" 或 “File -> New"。

（2）選擇實驗類型： 在實驗設(shè)置向?qū)е校x擇 “Quantitation (Standard Curve)"（標(biāo)準(zhǔn)曲線定量）、“Comparative Ct (ΔΔCt)"（相對定量）或其他適合您實驗的類型。

（3）設(shè)置探針/染料： 在 “Detectors" 或 “Dye Manager" 中，添加您實驗中使用的熒光染料（如 FAM, VIC）或探針。為每個檢測目標(biāo)指定名稱和報告基團(tuán)/淬滅基團(tuán)類型。

（4）設(shè)置反應(yīng)體系： 指定反應(yīng)體積（通常為20-50 μL）。

3、配制PCR反應(yīng)體系

（1）在冰上或超凈工作臺中操作： 確保所有試劑解凍并短暫離心。

（2）配制預(yù)混液： 根據(jù)實驗設(shè)計，按比例混合除模板DNA外的所有試劑（如Master Mix、引物、探針、水）。建議配制一定冗余（例如，多配10%的量）以補(bǔ)償加樣誤差。

（3）分裝： 將預(yù)混液分裝到PCR反應(yīng)板或八連管中。

（4）加入模板： 最后加入模板DNA，并輕輕混勻（避免產(chǎn)生氣泡）。強(qiáng)烈建議設(shè)置復(fù)孔（至少3個技術(shù)重復(fù)）以及陰性對照（No Template Control, NTC）和陽性對照。

（5）封膜： 使用光學(xué)封膜密封反應(yīng)板，確保封膜平整、無褶皺、無氣泡。然后用壓膜器或滾輪用力壓實邊緣。

4、上樣

（1）清潔樣品槽： 用無水乙醇和無塵紙輕輕擦拭7500儀器的樣品槽基座，去除任何灰塵或污染物。

（2）放置反應(yīng)板： 將封好膜的反應(yīng)板放入樣品槽中，確保反應(yīng)板的左上角（A1孔）對準(zhǔn)樣品槽的左上角標(biāo)記。輕輕向下按壓四角，確保板子放置平穩(wěn)。

二、第二階段：上機(jī)運行

1、創(chuàng)建運行方法

（1）設(shè)置反應(yīng)板布局： 在軟件界面，點擊 “Plate Setup" 選項卡。通過拖放或雙擊，為每個孔指定其樣品名稱、任務(wù)類型（未知樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照等）和對應(yīng)的檢測探針（Detector）。

（2）編輯運行程序：

點擊 “Instrument" 選項卡。

Stage 1 (升溫階段)： 通常為 50°C for 2 minutes（UDG酶防污染孵育，如果試劑包含此成分）。

Stage 2 (預(yù)變性)： 通常為 95°C for 10-20 minutes（熱啟動酶活化）。

Stage 3 (PCR循環(huán))： 設(shè)置40-50個循環(huán)，包括：

（3）變性： 95°C for 15 seconds。

退火/延伸： 60°C for 1 minute。在此步驟采集熒光信號。軟件通常會自動設(shè)置為在60°C階段采集信號。

（可選）溶解曲線階段： 如果使用SYBR Green染料，需添加溶解曲線步驟。

2、開始運行

（1）保存方法： 保存您的實驗文件和運行方法。

（2）啟動運行： 點擊工具欄上的 “Start Run" 按鈕。

（3）確認(rèn)運行參數(shù)： 在彈出的對話框中，再次確認(rèn)反應(yīng)板位置、運行方法文件名和樣品文件名無誤。

（4）開始運行： 點擊 “OK"，儀器將開始運行。運行過程中，您可以實時查看擴(kuò)增曲線和熒光信號的變化。

三、第三階段：數(shù)據(jù)分析與關(guān)機(jī)

1、數(shù)據(jù)分析

（1）運行結(jié)束后，軟件會自動保存數(shù)據(jù)。

（2）設(shè)置基線閾值（Threshold）和基線（Baseline）： 這是數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵步驟。

軟件通常會自動設(shè)置，但手動調(diào)整可能使結(jié)果更準(zhǔn)確。

閾值（Threshold）： 設(shè)置在指數(shù)擴(kuò)增期的線性范圍內(nèi)，通常為熒光信號剛進(jìn)入指數(shù)增長階段的水平。所有樣本的閾值線應(yīng)保持一致。

基線（Baseline）： 設(shè)置為背景熒光信號平穩(wěn)的循環(huán)數(shù)范圍（通常是前3-15個循環(huán)）。

（3）查看結(jié)果： 軟件會自動給出每個樣品的Ct值。您可以在 “Results" 頁面查看擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線（如果做了）、熔解曲線（如果做了）以及最終的定量結(jié)果。

2、關(guān)機(jī)

（1）取出反應(yīng)板： 運行結(jié)束后，打開儀器蓋子，小心取出反應(yīng)板。注意：反應(yīng)板可能很燙，請佩戴防燙手套。

（2）處理廢液： 根據(jù)您實驗室的生物安全規(guī)定，將反應(yīng)板作為生物有害廢物妥善處理。

（3）清潔樣品槽： 再次用無水乙醇和無塵紙清潔樣品槽。

（4）關(guān)閉軟件： 在電腦上退出7500系統(tǒng)軟件。

（5）關(guān)閉儀器： 先關(guān)閉7500儀器主機(jī)電源，然后再關(guān)閉電腦。

遵循以上標(biāo)準(zhǔn)操作流程，并結(jié)合您具體的實驗方案和試劑說明書進(jìn)行優(yōu)化，將能確保您獲得可靠、準(zhǔn)確的實時熒光定量PCR結(jié)果。如有任何不確定之處，請務(wù)必咨詢經(jīng)驗豐富的同事或賽默飛的技術(shù)支持。